草鱼抗菌免疫基因筛选及补体凝集素途径基因功

【2019-07-06】

  草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类之一。本论文利用高通量测序技术检测了草鱼感染嗜水气单胞菌(AH10)脾脏转录组。筛选草鱼抗菌免疫差异表达基因并研究了甘露糖结合凝集素(MBL)、甘露糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1(MASP-1)和补体C2的功能。研究内容及结果如下:1.草鱼脾脏mRNA转录组测序分析利用NextSeq 500技术平台,分别在7个时间点(0h、4h、8h、12h、24h、48h和72h)对腹腔注射AH10和PBS的草鱼脾脏cDNA文库进行高通量测序。获得149,514,670条raw reads,共42.67 G数据量。原始数据过滤后,共获得122,181,346条clean reads。经过拼接和组装后,191,795条基因注释到Nr、KO、GO、KOG、Swiss-Port和eggNOG数据库。通过筛选,获得2,992个免疫相关差异表达基因。参与到免疫系统的差异表达基因大多富集到补体系统中。基因差异表达分析和荧光定量PCR验证结果表明:(1)草鱼补体信号通路在抗菌免疫应答中起到重要的作用;(2)补体系统在草鱼感染4h后被激活;(3)补体基因mRNA呈波动表达模式,表明草鱼补体系统可能有信号传递的功能。2.MBL在抗菌感染中介导的免疫应答MBL能激活补体凝集素途径,在哺乳动物和硬骨鱼类中均起到重要的免疫作用。草鱼MBL(gcMBL)的cDNA全长为984 bp,包含741 bp的开放阅读框(ORF),编码246个氨基酸。gcMBL广泛分布在草鱼各组织中,表达量能被AH10、脂多糖(LPS)和鞭毛蛋白(FLA)影响。过表达细胞中发现除C5外,凝集素途径的下游分子在转录水平上均显著上调。用AH10、LPS和FLA分别刺激过表达细胞,发现补体受体、补体调节蛋白和炎症相关因子的表达量均显著上调。用AH10侵染敲减gcMBL的肝脏原代细胞,与对照组比较发现,上述各因子的表达量均被抑制。利用双荧光素酶检测系统研究发现,过表达gcMBL能显著激活NF-κB信号。综上所述,gcMBL基因在草鱼抗细菌侵染中起到重要的免疫作用。3.草鱼甘露糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1的免疫功能的研究露糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶(MASPs)是补体系统凝集素途径的重要组分,本研究利用转录组数据库中得到的草鱼MASP-1(gcMASP-1)序列进行研究,发现gcMASP-1基因的cDNA全长3308 bp,ORF全长为2160 bp,编码719个氨基酸,gcMASP-1在各物种间保守程度较高。组织表达谱分析结果显示,gcMASP-1基因广泛分布在各个组织中,相对较高的在心脏、肝脏和脑组织中表达。利用AH10侵染草鱼,发现gcMASP-1的表达量呈波动性变化;利用AH10、LPS和FLA刺激草鱼肝脏原代细胞,结果表明gcMASP-1的表达量随刺激时间的变化呈波动变化。在草鱼肝细胞中过表达gcMASP-1后,凝集素通路上游基因的表达量没有显著变化;但下游基因除C5外的表达水平均显著提高;同时,也可以诱导免疫相关基因gcil-1β,gcIFN和gcTNF-α的表达。利用AH10刺激过表达或抑制表达gcMASP-1的细胞,结果表明,过表达细胞中炎症因子等的表达量均显著上调;在敲减细胞中,上述因子等表达量被显著抑制。综上所述,gcMASP-1在草鱼凝集素途径中起到关键的抗菌免疫功能。4.草鱼补体C2在抗菌侵疫功中的作用和功能补体C2是凝集素途径中形成C3转化酶的重要组分。草鱼C2(gcC2)的cDNA全长为2684 bp,包含2523 bp的ORF,编码840个氨基酸,蛋白序列在物种间保守。gcC2的mRNA在草鱼各组织中均有表达。AH10能在草鱼体内和体外影响gcC2的表达量。同时,LPS和FLA能引起肝脏原代细胞中gcC2表达量的改变。在肝脏原代细胞中过表达gcC2能引起除C5外的补体系统下游组分表达量升高。利用AH10、LPS或FLA刺激过表达或敲减gcC2的肝脏细胞,结果显示,在过表达细胞中炎症因子等的表达量显著提高;在敲减细胞中被显著抑制。双荧光报告检测系统结果表明gcC2基因能激活核转录因子应答AH10感染。综上所述,gcC2基因在草鱼的先天免疫和激活补体下游组分中起到重要作用。

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